Procedimiento de identificación de la proteína humana ADAMTS-13.
Campo de la invención
La invención se adscribe al campo de los procesos biológicos de adhesión celular y remodelación tisular, incluyendo los asociados a condiciones fisiológicas como la respuesta inmune, la angiogénesis, la coagulación, la cicatrización de heridas, los procesos reproductivos, la implantación embrionaria, o el desarrollo fetal, así como procesos patológicos incluyendo los tumorales, artríticos, cardiovasculares, hematológicos y neurodegenerativos. En concreto, la presente invención versa sobre una proteína humana que contiene dominios de adhesión celular y metaloproteasa, sobre el gen que la codifica, y sobre sus posibles inhibidores. Más particularmente, la presente invención aborda la identificación de la proteína humana llamada ADAMTS-13, y el análisis de su estructura y de sus posibles funciones normales y patológicas.
Estado de la técnica
Las proteínas denominadas ADAMs (a disintegrin and metalloproteinase domain) o desintegrinas celulares, son una familia de enzimas que han adquirido una notable importancia dada su capacidad de participar en procesos biológicos que implican fenómenos de adhesión celular y proteolisis extracelular (Cell 90, 589, (1997) ) . Estas proteínas poseen una peculiar organización estructural con dominios de proenzima, metaloproteasa, desintegrina, rico en cisteína, factor de crecimiento epidérmico, transmembrana, y citoplasmático. Algunos de estos dominios son semejantes a los encontrados en una familia de proteínas aisladas de venenos de serpientes (Methods Enzymol. 248, 345, (1995) ) . Estas proteínas de serpientes junto con las ADAMs, constituyen la superfamilia de las reprolisinas, caracterizadas por la presencia de una secuencia HEXXHXXGXXHD en su dominio catalítico.
Las ADAMs han sido identificadas en una variedad de tejidos de mamíferos, así como en otros organismos eucariotas como Xenopus laevis, Drosophila melanogaster y Caenorhabditis elegans, pero no en plantas, levaduras o bacterias. Inicialmente, las ADAMs se asociaron a procesos reproductivos, pero posteriormente su espectro de funciones se ha extendido considerablemente (Curr. Ópin. Cell Biol. 10, 654, (1998) ) . Así, la meltrina-α (ADAM-12) se ha implicado en fusión de mioblastos. Las meltrinas α y β también participan en procesos de diferenciación y actividad osteoblástica. Otras ADAMs como las denominadas MS2 y decisina, participan en distintos procesos de la respuesta inmune. Además, estudios recientes han permitido caracterizar las propiedades enzimáticas y especificidad de sustrato de varias ADAMs como ADAM-9, ADAM-10 o ADAM-17 que actúan como proteasas implicadas en el procesamiento proteolítico de sustratos celulares relevantes, incluyendo precursores de citoquinas y factores de crecimiento.
La complejidad estructural y funcional de esta familia de proteínas se ha extendido considerablemente tras el reciente hallazgo de una serie de nuevas proteasas relacionadas con las ADAMs y caracterizadas por la presencia en su secuencia de aminoácidos de varias copias de dominios trombospondina (J. Biol. Chem. 274, 25555, (1999) ) . El primer miembro de esta subfamilia, denominado ADAMTS-1, se identificó como consecuencia de su asociación con el desarrollo de caquexia tumoral y de varios procesos inflamatorios. Posteriormente, se identificó la ADAMTS-2, con actividad de procolágeno I amino-proteasa y cuya deficiencia origina el síndrome de Ehlers-Danlos tipo VIIC (Am. J. Hum. Gen. 65, 308, (1999) ) . Otros miembros de la familia son las proteínas denomminadas ADAMTS-4 y ADAMTS-11, las cuales poseen la actividad agrecanasa responsable de la degradación del cartílago articular en enfermedades artríticas. Por otra parte la ADAMTS-8 y la ADAMTS-1 han sido identificadas como proteínas capaces de inhibir los procesos de angiogénesis. Finalmente, otras proteínas como las ADAMTS-3, ADAMTS-5, ADAMTS-6, ADAMTS-7 y ADAM-TS12 sólo se han caracterizado al nivel estructural y sus funciones todavía no han sido aclaradas. Todas estas proteínas tienen una organización similar en dominios, pero difieren sustancialmente de la estructura prototipo de las ADAMs. Así, las ADAMTS-s carecen del dominio de factor de crecimiento epidérmico, la región transmembrana, y la cola citoplasmática características de las ADAMs, pero contienen una serie de copias de trombospondina, que representan la característica distintiva de los miembros de esta familia de proteínas. El hallazgo de que las ADAMTS pueden estar implicadas en una amplia variedad de procesos biológicos y patológicos ha estimulado la búsqueda de nuevos componentes de la familia.
Una de las estrategias para la identificación de nuevas ADAMTS humanas consistiría en la aplicación de métodos de clonación por homología. Una de las múltiples formas de abordar este método, persigue en un primer paso la búsqueda en bancos de datos accesibles públicamente, de fragmentos de secuencias denucleótidos de genes humanos generados de manera aleatoria y que tengan similitud con las secuencias de los genes de las desintegrinas ya conocidas. Tras su identificación, los hipotéticos fragmentos homólogos se pueden amplificar mediante PCR de ARN 'total de tejidos humanos en los que se sospeche la expresión de dichos genes, y utilizarlos como sondas para hibridar genotecas de ADNc preparadas a partir de ARN de los mismos tejidos. Alternativamente, se puede extender la secuencia hacia los extremos 5' o 3' mediante técnicas de amplificación rápida de los extremos de los ADNcs (RACE) . Finalmente, la secuenciación y posterior caracterización de los clones humanos aislados mediante técnicas estándar de Biología Molecular, permitiría confirmar la identificación de nuevas ADAMTS y definir el posible papel de las proteínas codificadas por dichos clones en procesos normales y patológicos de adhesión celular o proteolisis. Basándose en esta idea, los autores de la invención, tras los pertinentes estudios experimentales, han llegado a los objetivos antes enumerados que constituyen los diversos aspectos de la presente invención.
Breve descripción de la invención
Un objeto de la presente invención es identificar el gen humano que codifica una nueva proteína humana denominada ADAMTS-13.
Un segundo objeto de la invención es analizar la expresión en tejidos humanos del gen de la ADAMTS-13.
Un tercer objeto de la invención es analizar la expresión del gen de la ADAMTS-13 en tumores humanos.
Descripción detallada de la invención
El primer objeto de la invención consistió en la identificación de un gen humano que pudiera codificar una nueva ADAM humana. Para ello la secuencia de aminoácidos de regiones conservadas en las ADAMs descritas se comparó con la división de Expressed Sequence Tags (ESTs) de la base de datos GenBank utilizando el programa TBLASTN (J. Mol. Biol. 215, 403, (1990) ) . Se identificó una EST humana, cuyo número de acceso es AI806237. A partir de la secuencia de nucleótidos de esta EST, se diseñaron y sintetizaron dos oligonucleótidos, AD-1 (5'-CTGCCGGCGGCTGCAGGGGGA-3') y AD-2 (5'-GGACCCGTCCCTGGGGGCTCA-3') . Estos oligonucleótidos fueron utilizados para amplificar el fragmento de ADNc correspondiente, empleando como molde DNA total aislado a partir de una genoteca de ADNc humano de hígado fetal. Para ello se utilizaron 20 pmoles de cada oligonucleótido, aproximadamente 1 microgramo de ADNc, 0, 2 mM dNTPs y 1, 25 U de Taq DNA polimerasa en un volumen total de 50 microlitros de tampón ExpandLong 3 (Boehringer Mannheim) . La amplificación se llevó a cabo en un aparato GeneAmp2400 de Perkin-Elmer, y consistió en 400 ciclos de desnaturalización (15 s, 94ºC) , hibridación (20 s, 64ºC) y extensión (20 s, 72ºC) . El fragmento de DNA resultante, de 460 pares de bases (pb) se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa y posterior extracción con GeneClean. La identidad del fragmento amplificado con la secuencia parcial de la EST-AI806237 se verificó tras subclonarlo en pUC18 y determinar su secuencia de nucleótidos mediante técnicas estándar de Biología Molecular.
Con el fin de obtener una secuencia de ADNc que contuviera la información codificante de la proteína completa, el producto de PCR obtenido con los oligonucleótidos AD-1 y AD-2, se marcó radiactivamente y se utilizó como sonda para hibridar una genoteca de ADNc de pulmón fetal humano. Tras el escrutinio de aproximadamente lx106 unidades formadoras de placa, se obtuvo un clon con hibridación positiva cuya secuencia de nucleótidos se determinó mediante métodos convencionales. El análisis de dicha secuencia reveló que este clon contenía un inserto de 1.4 kb, que parecía estar incompleto en su extremos 5' y 3'. Dicha región se extendió mediante técnicas de amplificación rápida de extremos de ADNcs utilizando ARN de hígado fetal humano y el método Marathon de Clontech. Tras una serie de amplificaciones sucesivas se obtuvo un fragmento que contenía un codón de terminación en la misma fase de lectura que el resto del ADNc identificado. Finalmente, el ADNc codificante completo se obtuvo por amplificación con los oligonucleótidos ADTS13F (5'-ATGCACCAGCGTCACCCCCGG-3') y ADTS13R (5'-GGTTCCTTCCTTTCCCTTCCAG-3') . El análisis informático de la secuencia obtenida reveló la existencia de una fase abierta de lectura, que codifica una proteína de 1340 aminoácidos a la que denominamos ADAMTS-13. Su secuencia de aminoácidos, así como la secuencia nucleotídica que la codifica se muestra como SEQ ID NO :1. La comparación de esta secuencia de aminoácidos con todas las secuencias presentes en los bancos de datos accesibles públicamente demostró la existencia de un grado significativo de similitud con otras ADAMs y más específicamente con miembros de la subfamilia de las ADAMTS (J. Biol. Chem. 274, 25555, (1999) ) . Así, la proteína presenta todos los motivos característicos de estos enzimas incluyendo la secuencia señal, el propéptido, los dominios metaloproteasa, desintegrina y rico en cisteína, así como diversas repeticiones tipo trombospondina (TS) .
Un análisis más detallado de la secuencia de aminoácidos deducida para la ADAMTS-13, confirmó que ésta posee el predominio más corto entre todos los miembros de la familia. En él se localizan dos residuos cisteína (posiciones 27 y 37) que podrían estar implicados en el mantenimiento de la latencia enzimática. Este predominio termina en un motivo dibásico que podía corresponder al sitio de activación por furina, que poseen estos enzimas. El dominio catalítico incluye la secuencia HEXXHXXGXXHD (posiciones 224-235) implicado en la coordinación del átomo de zinc en el centro activo de las metaloproteasas, y con el residuo de ácido aspártico que permite distinguir las reprolisinas de las MMPs. Este dominio también posee el residuo de metionina (posición 249) que contribuye a formar la estructura Met-giro presente en reprolisinas y MMPs. Tras el dominio catalítico puede reconocerse el dominio desintegrina, similar en tamaño al de otras ADAMTS y con las ocho cisteínas altamente conservadas en dicha región. Finalmente, el dominio rico en cisteínas muestra un alto porcentaje de identidades (alrededor del 50%) con el dominio equivalente presente en otras ADAMTS incluyendo los diez residuos de cisteína conservados en todas ellas. Por todo ello, podemos concluir que la proteína identificada pertenece a la familia de las ADAMTS y ha sido denominada ADAMTS-13 La secuencia fue depositada en el banco de datos EMBL con el número de acceso AJ305314) . Tanto el ADN aislado como el polipéptido codificado, representados en SEQ ID NO:1, como secuencias parciales obtenidas de ambos, pueden sintetizarse químicamente también.
El segundo objeto de la invención es analizar la expresión en tejidos humanos del gen de la ADAMTS-13. Con este fin, tres membranas conteniendo ARN poliadenilado procedente de múltiples tejidos humanos adultos (leucocitos, colon, intestino delgado, ovario, testículo, próstata, timo, bazo, páncreas, riñón, músculo esquelético, hígado, pulmón, placenta, cerebro y corazón) y fetales (cerebro, pulmón, hígado y riñón) se hibridaron con una sonda específica de ADAMTS-13 (276 pb, correspondiente a la región comprendida entre los aminoácidos 81 a 172) marcada radiactivamente. Tras una prehibridación a 42ºC durante tres horas en formamida al 40%, 5x PBS/EDTA (1x=NaCl 150 mM, NaH2PO4 10 mM, EDTA 1mM, pH 7, 4) , 10x disolución de Denhardt (lx= Albúmina de suero bovino, 0, 02%, polivinilpirrolidona, 0, 02%, ficoll, 0, 02%) , SDS 2% y DNA de esperma de salmón 100 mg/ml, se añadió la sonda y se hibridó durante 20 horas en las mismas condiciones. Los filtros se lavaron con lx SSC (NaCl 150 mM, citrato sódico 15 mM, pH 7, 0) conteniendo SDS al 0, 1% durante 2 horas a 50ºC, y finalmente se expusieron a autorradiografía (Fig. 1) . Como puede observarse en la figura 1, tras hibridación con la sonda de ADAMTS-13, se detectó un ARN mensajero de aproximadamente 4.5 en hígado, tanto fetal como adulto, y un segundo transcrito de 2.4 kilobases mayoritariamente en hígado fetal, aunque su expresión también se localiza en otros tejidos como riñón y pulmón fetales, placenta y músculo de tejidos adultos, y en diversos tipos celulares incluyendo células endoteliales.
El tercer objeto de la invención consistió en el estudio de la expresión del gen de la ADAMTS-13 en muestras obtenidas de carcinomas humanos. Estos estudios se llevaron a cabo mediante análisis Northern utilizando ARN total extraido de diversas líneas tumorales humanas. Las correspondientes membranas se hibridaron con una sonda específica de ADAMTS-13 (276 pb) marcada radiactivamente utilizando las mismas condiciones que las descritas para el análisis de expresión de ADAMTS-13 en tejidos normales. Como puede observarse en la figura 2, tras hibridación con la sonda de ADAMTS-13, se detectó un ARN mensajero de aproximadamente 2.4 kilobases en algunas líneas tumorales como las denominadas SW480 y G361 derivadas de carcinoma de colon y de melanoma maligno humanos respectivamente. Estos resultados demuestran que que la ADAMTS-13 se produce en carcinomas derivados de tejidos en los que en condiciones normales no se expresa dicho gen. Estos resultados confirman la propuesta de que la ADAMTS-13, a través de posibles funciones como proteasa, y/o como molécula reguladora de procesos de adhesión celular, hemostasis y angiogénesis, puede también asociarse a patologías que implican destrucción tisular como el cáncer.
Descripción de las figuras
Figura 1. Análisis Northern de la expresión del gen ADAMTS-13 en tejidos humanos adultos y fetales. Dos microgramos de ARN poliadenilado de los tejidos indicados se hibridaron con un fragmento del ADNc de ADAMTS-13. El origen del ARN de los distintos tejidos, así como el tamaño del los distintos ARNs utiizados como marcadores quedan indicados. Las membranas se hibridaron con una sonda de actina para asegurar la igualdad en la cantidad de ARN cargado en las distintas calles.
Figura 2. Análisis Northern de la expresión del gen ADAMTS-13 en líneas tumorales humanas. 20 microgramos de ARN total de las líneas tumorales indicadas se hibridaron con un fragmento del ADNc de ADAMTS-13. A la derecha se indica el tamaño de los ARNs utilizados como marcadores.
