Procedimiento de identificación de las metaloproteasas murina Mcol-A y Mcol-B.
Procedimiento de identificación de las metaloproteasas murina Mcol-A.
Campo de la invención
La invención se enmarca dentro del estudio de los procesos biológicos de remodelación tisular, incluyendo los asociados a condiciones fisiológicas como el desarrollo fetal, la implantación embrionaria, la cicatrización de heridas, la angiogénesis, o los procesos reproductivos, así como procesos patológicos incluyendo los artríticos, tumorales, neurodegenerativos y cardiovasculares. En concreto, la presente invención versa sobre la identificación de una metaloproteasa de matriz extra-celular, sobre el gen que la codifica, y sobre sus posibles inhibidores. Más particularmente, la presente invención aborda la identificación de la proteasa murina denominada Mcol-A, y el análisis de su estructura y de sus posibles funciones normales y patológicas.
Estado de la técnica
La remodelación proteolítica de la matriz extracelular es un acontecimiento esencial en múltiples procesos fisiológicos y patológicos. Numerosos trabajos han permitido concluir que las metaloproteasas de matriz extracelular (MMPs) desempeñan un papel fundamental en todos estos procesos (J. Biol. Chem. 274, 21491, (1999) ) . Estos enzimas constituyen una familia de endopeptidasas dependientes de zinc que son capaces de degradar a pH neutro los diversos componentes proteicos de la matriz extracelular. Hasta el momento, se han identificado más de 20 MMPs que de acuerdo con su especificidad de sustrato, estructura primaria y localización celular, pueden clasificarse en cinco grupos: colagenasas, gelatinasas, estromelisinas, MT-MMPs y otras. La mayoría de los miembros de la familia de las MMPs se organizan en tres dominios distintivos y bien definidos: un propéptido amino-terminal con un residuo conservado de cisteína implicado en el mantenimiento de la latencia enzimática; un dominio catalítico con un sitio de unión a zinc; y un dominio hemopexina localizado en la región carboxi-terminal.
La subfamilia de las colagenasas humanas consiste de tres miembros distintos: la colagenasa de fibroblastos (MMP-1) , la colagenasa de neutrófilos (MMP-8) y la colagenasa-3 (MMP-13) . La caracterización bioquímica de estas colagenasas ha revelado que todas comparten la capacidad de hidrolizar el colágeno fibrilar en un enlace peptídico específico, lo cual conduce a la generación de dos fragmentos, cuyos tamaños son aproximadamente de 3/4 y 1/4 del de la molécula intacta. Estos fragmentos se desnaturalizan espontáneamente a temperatura fisiológica, siendo entonces susceptibles de ser hidrolizados por otras MMPs. Es interesante destacar que las tres colagenasas humanas muestran distinta preferencia de sustrato frente a los distintos colágenos fibrilares. Así, la MMP-1 degrada preferentemente colágeno tipo III, la MMP-8 el colágeno tipo I y la MMP-13 degrada el colágeno tipo II 6 veces mejor que el I o el III. Estas observaciones han permitido proponer que las diferentes colagenasas humanas han evolucionado como enzimas especializados para participar en el remodelado de tejidos con diferente composición de colágenos. Asimismo, el hecho de que su distribución tisular y mecanismos de regulación transcripcional sean diferentes apoyan la idea de que las diversas colagenasas puedan tener distintas funciones, tanto en procesos fisiológicos como patológicos. Para poder corroborar esta hipótesis de forma experimental, es esencial contar con la disponibilidad de modelos animales en los cuales la actividad de los diferentes enzimas pueda ser manipulada de forma selectiva. Con este objetivo general, los autores de la presente invención han llevado a cabo una búsqueda de nuevos genes de metaloproteasas en genotecas murinas de DNA genómico utilizando como sonda el cDNA de la colagenasa de fibroblastos humana (MMP-1) . Como resultado de esta búsqueda se han identificado dos nuevos miembros de la familia de las MMPs relacionados con la MMP-1 humana. Tras los pertinentes estudios experimentales han llegado a los objetivos que constituyen los diversos aspectos de la presente invención
Breve descripción de la invención
Un objeto de la presente invención es identificar genes murinos que codifican proteínas relacionadas con la colagenasa de fibroblastos humana o MMP-1.
Un segundo objeto de la invención es analizar la expresión de los genes identificados durante el desarrollo embrionario.
Un tercer objeto de la invención es analizar la actividad colagenolítica de las proteínas recombinantes producidas en E. coli.
Descripción detallada de la invención
El primer objeto de la invención consistió en la identificación de genes murinos que pudieran codificar proteínas relacionadas con la colagenasa de fibroblastos o MMP-1 humana. Para ello se utilizó el cDNA que codifica la MMP-1 humana como sonda para hibridar una genoteca genómica de ratón clonada en PACs (P1 artificial chromosomes) . A partir de uno de los clones positivos obtenidos (PAC 528 C11) , se realizaron análisis de restricción y se obtuvieron secuencias parciales de DNA de los fragmentos con hibridación positiva con la sonda de la MMP-1 humana. Estas secuencias permitieron identificar varios exones que codificaban una nueva MMP murina. A partir de la secuencia de nucleótidos de los posibles exones 1 y 10, se diseñaron y sintetizaron dos oligonucleótidos, que fueron utilizados para amplificar el fragmento de cDNA correspondiente, empleando como molde RNA total aislado a partir de embriones de ratón en distintos estadios de desarrollo. En primer lugar, se llevó a cabo una transcripción reversa de RNA a cDNA, utilizando el kit de RNA-PCR de PE Biosystems. La subsiguiente amplificación se realizó utilizando 20 pmoles de cada oligonucleótido, aproximadamente 1 microgramo de cDNA, 0, 2 mM dNTPs y 1, 25 U de Taq DNA polimerasa en un volumen total de 50 microlitros de tampón ExpandLong 1 (Boehringer Mannheim) , en un aparato GeneAmp2400 de PE Biosystems, y consistió en 40 ciclos de desnaturalización (15 s, 94°C) , hibridación (20 s, 60°C) y extensión (50 s, 72°C) . El fragmento de DNA resultante, se purificó por electrofóresis en gel de agarosa y extracción con GeneClean y se subclonó en pUC18. La determinación de la secuencia de nucleótidos mediante técnicas estándar de Biología Molecular reveló una pauta abierta de lectura que codificaba una proteína de 464 aminoácidos con una posible masa molecular de 53.5 kDa, y que fue denominada Mcol-A (Murine collagenase-like A) . Esta secuencia de aminoácidos, así como la secuencia nucleotídica que la codifica se muestra como SEQ ID N°:1.
La comparación con todas las secuencias presentes en los bancos de datos accesibles públicamente demostró la existencia de un grado significativo de similitud con otras MMPs, siendo el máximo grado el que presenta con la MMP-1 humana (58% de identidades en aminoácidos y 74% en nucleótidos) . El análisis detallado de las secuencias también reveló que la Mcol-A presenta todas las características estructurales propias de una MMP típica. Así, la proteína presenta una secuencia amino-terminal adyacente a la metionina iniciadora y rica en aminoácidos hidrofóbicos que correspondería a la secuencia señal que dirige a estas proteínas a la ruta secretora. Esta secuencia es seguida por un prodominio con el locus de activación que contiene el residuo de cisteína (en posición 88) esencial para el mantenimiento de la latencia enzimática. La secuencia identificada posee un dominio catalítico de alrededor de 170 residuos incluyendo la secuencia HEXGHXXGXXHS (en posiciones 214-225) implicada en la unión de iones metálicos. El dominio catalítico también contiene un residuo de metionina, localizado a siete aminoácidos de distancia del sitio de unión al zinc, y conservado en todas las MMPs. Finalmente, la secuencia identificada posee un fragmento C-terminal de unos 200 aminoácidos, cuya secuencia presenta similitud con la hemopexina. Tanto el ADN aislado como el polipéptido codificado, representado en SEQ ID N°:1, como secuencias parciales obtenidas de ambos, pueden sintetizarse químicamente también.
El segundo objeto de la invención es analizar la expresión del gene Mcol-A durante el desarrollo embrionario murino. Con este fin se transfirió a una membrana de nylon el RNA separado electroforéticamente procedente de embriones de ratón en distintas fases de desarrollo. Tras una prehibridación a 42°C durante tres horas en formamida al 40%, 5x PBS/EDTA (1 x=NaCl 150 mM, NaH2PO4 10 mM, EDTA 1mM, pH 7, 4) , 10x disolución de Denhardt (1x= Albúmina de suero bovino, 0, 02%, polivinilpirrolidona, 0, 02%, ficoll, 0, 02%) , SDS 2% y DNA de esperma de salmón 100 mg/ml, se añadieron las sondas radiactivas y se hibridaron durante 20 horas en las mismas condiciones. Los filtros se lavaron con 1x SSC (NaCl 150 mM, citrato sódico 15 mM, pH 7, 0) conteniendo SDS al 0, 1% durante 2 horas a 50°C, y finalmente se expusieron a autorradiografía (Fig. 1) . Como puede observarse en la figura 1a, tras hibridación con la sonda de Mcol-A, se detectó hibridación específica en RNA procedente de saco vitelino y de tejido uterino adyacente de especímenes de 9.5 y 10.5 días de desarrollo embrionario, así como en placenta de 13.5, 15.5 y 17.5 días de desarrollo. Esta expresión también fue comprobada en experimentos de PCR acoplada a transcripción reversa, como se muestra en la figura 1b.
La expresión restringida de Mcol-A en placenta y tejido uterino extraembrionario está de acuerdo con su posible implicación en procesos de implantación y desarrollo embrionarios, mientras que su expresión anómala en estos tejidos puede ser responsable de problemas de infertilidad, abortos o enfermedades como la preeclampsia. La falta de expresión significativa del gen estudiado en los demás tejidos normales analizados está de acuerdo con el patrón de expresión de muchas MMPs, que sólo se expresan en procesos de remodelación tisular tanto normales como patológicos.
El tercer objeto de la invención consistió en analizar la actividad colagenolítica de la proteína recombinante producida en E. coli. Para llevar a cabo estos estudios, en primer lugar se subclonó el fragmento de cDNA que codifica el prodominio, el dominio catalítico y el dominio hemopexina de la proteína Mcol-A en el vector de expresión pRSETB (Invitrogen) . Este fragmento fue generado por amplificación mediante PCR utilizando como cebadores los oligonucleótidos 5'-ggctcgagaTTCCCTGTGATTCA GGAT y 5'-ggaattcTTAGCAGTTGAACCAAGTATTAAT. La amplificación mediante PCR se llevó a cabo en 30 ciclos de desnaturalización (95°C, 15s) , hibridación (56°C, 15s) y extensión (68°C, 2 min) , utilizando el kit Expand Long High Fidelity (Roche Molecular Biochemicals) en un termociclador GeneAmp 9700 PCR system (PE Biosystems) . El producto amplificado por PCR se digirió con EcoRI y XhoI y se subclonó en el vector de expresión pRSETB previamente digerido con los mismos enzimas. El vector de expresión generado se transformó en la cepa de E. coli BL21 (DE3) pLysS. Para llevar a cabo la producción de proteína recombinante, las bacterias transformadas con los vectores de expresión se cultivaron en 200 ml de medio 2YT conteniendo ampicilina y cloranfenicol. Cuando los cultivos alcanzaron una OD600 de 0.6, se indujeron añadiendo 0.5 mM de isopropil-1 -tio-b-D-galactopiranósido (IPTG) , y continuando la incubación durante 3 a 20 h a 30°C. La producción de proteína fue monitorizada mediante electrofóresis en gel de poliacrilamida. Los cuerpos de inclusión se produjeron tras incubar los cultivos a 37°C durante una noche, tras lo cual se purificaron y se solubilizaron en tampón 20 mM Tris/HCl pH 8.0, 5 M cloruro de guanidinio y 5 mM 2-mercaptoetanol y se diluyeron en el tampón de replegamiento (20 mM Tris/H2SO4, pH 7.5, 5 mM Ca SO4, 100 mM Na2SO4, 0.5 μM ZnSO4, 2% glicerol, 0.05% NaN3) . Finalmente, la proteína recombinante fue purificada utilizando una columna de afinidad de agarosa y Ni-NTA. La actividad enzimática de la proteína recombinante Mcol-A frente a colágenos fibrilares se monitorizó mediante electrofóresis en poliacrilamida-SDS. Los ensayos se efectuaron en tampón 50 mM Tris/HCI, 5 mM CaCl2, 150 mM NaCl y 0.05% (v/v) Brij 35, pH 7.6 durante 16 h a 37°C. La relación enzima/sustrato (w/w) utilizada fue de 1/10.
Los estudios realizados señalaron que la proteína recombinante se activa autoproteolíticamente, lo cual indica que está correctamente plegada y posee actividad enzimática. La proteína Mcol-A es capaz de hidrolizar las moléculas de colágeno tipo II generando fragmentos de 3/4 y 1/4 del tamaño de las moléculas originales (Fig. 2) .
Descripción de las figuras
Figura 1. Análisis Northern de la expresión del gen Mcol-A en tejidos embrionarios de ratón. a) Se separaron electroforéticamente en condiciones desnaturalizantes muestras de 20 μg de RNA total procedente de embrión completo (WE) , saco vitelino (YS) o placenta (P) . Tras la electrofóresis, se transfirieron a membranas de nylon y se analizaron por hibridación con la sonda correspondiente al cDNA completo de Mcol-A marcada radiactivamente. Los filtros se sometieron a autorradiografía a -70°C durante 7 días utilizando películas y pantallas Kodak BIOMAX MS. b) Experimentos de PCR acoplada a transcripción reversa de RNA (RT-PCR) se llevaron a cabo utilizando 1 μg de RNA procedente de embriones completos o placenta en diferentes estadios de desarrollo. La reacción se llevó a cabo en 50 μl de volumen utilizando oligonucleótidos específicos para amplificar Mcol-A. 20 μl del producto final se separaron en electrofóresis de agarosa al 2%. La calle BI muestra un experimentos de RT-PCR sin RNA molde añadido. La calle de marcadores corresponde a Marker V de Boehringer Mannheim.
Figura 2. Análisis de la actividad de Mcol-A recombinante sobre colágeno tipo II. El producto de digestión se analizó en electrofóresis de poliacrilamida-SDS bajo condiciones reductoras y teñido con azul de Coomassie (calle 1) . La calle 2 es colágeno tipo II incubado sólo con los tampones de digestión.
