Anticuerpo monoclonal humano SM50/20 que reconoce leucocitos humanos, y su uso en terapia.
La presente invención se refiere a un anticuerpo monoclonal humano, denominado SM50/20 que reconoce específicamente un antígeno presente en leucocitos humanos y en algunas líneas tumorales leucocitarias humanas de tipo B y T. El anticuerpo también reconoce células de sangre periférica y de médula ósea procedentes de pacientes con leucemias linfoides crónicas tipo B (ver tabla 1). El anticuerpo monoclonal humano SM50/20 es producido por un hibridoma murino y presenta el isotipo de una inmunoglobulina M humana (IgM), con cadenas pesadas humanas m y con cadenas ligeras humanas k .
Sector de la técnica
El sector de la técnica al que se refiere la invención se incluye dentro del ámbito sanitario. La utilización de este anticuerpo monoclonal en terapia humana, puede suponer una considerable ventaja dada la ausencia de terapias efectivas en muchas leucemias y puede minimizar al máximo el riesgo de ser rechazada inmunológicamente por el paciente, como ocurre actualmente en muchos casos, con la terapia antitumoral que utiliza anticuerpos murinos.
Antecedentes de la invención
Los anticuerpos monoclonales representan en la actualidad una terapia efectiva en gran número de patologías, como en diversos tipos de tumores (cáncer de mama, leucemias, etc..), para evitar rechazo de trasplantes, en el tratamiento de enfermedades autoinmunes, etc.. Sin embargo, la mayor parte de los anticuerpos monoclonales existentes son de ratón o de rata, lo que lleva en muchos casos a rechazos inmunológicos por parte de los pacientes que reciben esa terapia, y por tanto a la inutilidad terapéutica. En los últimos años se han intentado modificar estos anticuerpos murinos mediante técnicas de biología molecular, para asemejarlos lo más posible a los anticuerpos humanos, disminuyendo así los riesgos del potencial rechazo del paciente frente a estas proteínas extrañas al organismo. Surgen así los anticuerpos quiméricos y humanizados, que son los que mayoritariamente están ahora utilizándose en clínica.
El problema se resolvería si fuera posible obtener anticuerpos monoclonales totalmente humanos. Sin embargo, la obtención y aplicación de anticuerpos monoclonales humanos en terapia humana han encontrado numerosos obstáculos. Las técnicas convencionales de obtención de anticuerpos monoclonales mediante la técnica de Cesar Milstein y George Köhler (técnica que no es patentada y es de dominio público), no ha podido ser aplicada con éxito en humanos y se hace necesario buscar estrategias alternativas para producir anticuerpos humanos que puedan ser útiles en terapia humana y que a su vez reconozcan un determinado antígeno humano con alta afinidad.
En los últimos años se han desarrollado ratones transgénicos portadores de genes de IgM humana/kappa humana y carentes de los correspondientes genes para cadena pesada y cadena ligera kappa murinos, aunque sí presentan la cadena ligera lambda murina. Estos ratones pueden ser inmunizados con antígenos humanos, y responden de forma específica frente a estos antígenos con anticuerpos humanos de tipo IgM. Utilizando la técnica convencional de obtención de anticuerpos monoclonales antes comentada de Milstein y Köhler, es posible obtener de estos ratones, hibridomas productores de anticuerpos humanos dirigidos frente a antígenos específicos también humanos. En la presente invención se presenta un hibridoma obtenido con estos ratones que es capaz de secretar un anticuerpo monoclonal humano IgM que reconoce de forma específica leucocitos humanos, tanto normales como tumorales, y que presenta características estructurales y funcionales indistinguibles de un anticuerpo humano. Este anticuerpo puede ser de mucha importancia terapéutica en patologías de tipo leucemias, linfomas, mielomas u otras, dada la ausencia de terapias efectivas en muchas de estas patologías.
Explicación de la invención
El objetivo es la obtención de un anticuerpo monoclonal humano frente a leucocitos humanos. El problema con la mayor parte de los anticuerpos monoclonales utilizados en terapia humana existentes actualmente es que son de ratón o de rata, o modificados genéticamente en parte pero no totalmente. Esto lleva a que los pacientes que reciben estos anticuerpos como tratamiento para diversas patologías (tumores, enfermedades autoinmunes, infartos, evitar rechazo de trasplantes, etc...) generan una respuesta inmunitaria frente a esas proteínas extrañas, llevando a la inutilidad del tratamiento. Se hace así necesario desarrollar anticuerpos monoclonales totalmente humanos que no sean rechazados al ser utilizados en terapéutica.
Algunas de las patologías tumorales que se están beneficiando de estos anticuerpos monoclonales son sobre todo leucemias y linfomas, lo que nos llevó a trabajar en este campo para obtener un anticuerpo monoclonal humano que pudiera reconocer células humanas de sangre periférica
Descripción breve de la invención
Se ha obtenido un hibridoma productor de un anticuerpo monoclonal humano. El anticuerpo monoclonal humano SM50/20 secretado por el hibridoma es una Inmunoglobulina M humana, con cadenas pesadas m y cadenas k , ambas humanas. El anticuerpo monoclonal humano SM50/20 identifica un antígeno de membrana en la superficie de leucocitos normales, líneas celulares tumorales T y B, células tumorales derivadas de pacientes con leucemias linfoides crónicas, y de algunas leucemias mieloides crónicas. El hibridoma ha sido depositado en la ECACC con el número de acceso 01111618.
Su patrón de reconocimiento de alta intensidad sobre células tumorales, indica que este anticuerpo podría ser útil en la eliminación tanto in vitro (eliminación de células tumorales previo a transplantes de médula ósea) como in vivo, de células tumorales leucémicas.
Descripción detallada de la invención
Los ratones transgénicos utilizados para la generación del hibridoma proceden del Instituto Babraham y del Medical Research Council de Cambridge, Inglaterra. Los ratones fueron utilizados como parte del proyecto conjunto europeo BIO4-CT97-2284 del programa "Biotechnology". Los ratones fueron originalmente generados tras el cruce entre ratones transgénicos portadores de genes humanos de la cadena pesada m y de la cadena ligera k , con ratones knockout para los correspondientes genes endógenos de la cadena pesada m y de la cadena ligera k . De esta manera, los ratones transgénicos utilizados sólo producen IgM humana con cadenas ligeras kappa o lambda también humanas.
Los ratones transgénicos fueron inmunizados con 10-20 millones de leucocitos humanos obtenidos de sangre periférica de donantes voluntarios sanos. Los leucocitos humanos fueron inyectados intraperitonealmente en los ratones, en presencia de adyuvante completo (primera inmunización) o incompleto (segunda inmunización) de Freund. Entre la primera y la segunda inmunización transcurrió entre 15 días-2 meses. Una tercera inmunización se realizó vía intravenosa con leucocitos humanos sin adyuvante, entre 18-20 días después de la segunda inmunización. El suero de todos los ratones previo a su inmunización y tras inmunización específica fue testado por ELISA para delimitar su secreción de anticuerpos IgM humanos. Tres días después de la última inmunización se extrajo el bazo en condiciones estériles y se realizó una suspensión celular. Las células del bazo se fusionaron con células del mieloma murino SP2/0, utilizando la técnica convencional de obtención de anticuerpos monoclonales que les valió el premio Nobel a los Dres Köhler y Milstein. Este mieloma murino SP2/0 no secreta inmunoglobulinas endógenas y es deficitario en el enzima hipoxantina fosforribosil transferasa. La fusión se realizó en presencia del agente fusionante Polietilenglicol. Las células fusionadas que corresponden a las células híbridas o hibridomas se mantuvieron en medio selectivo HAT. El sobrenadante de los cultivos se testó mediante ELISA y citometría de flujo, y se seleccionó un hibridoma secretor de un anticuerpo humano IgM (isotipo IgM/k ) por su capacidad de reconocer leucocitos humanos y líneas celulares tumorales humanas (ver Tabla 1). Se procedió a la clonación del hibridoma productor del anticuerpo monoclonal humano SM50/20 mediante la técnica de dilución límite utilizando placas de 96 pocillos. Este paso se realizó 2 veces hasta asegurar la monoclonalidad del hibridoma.
La célula secretora de este anticuerpo, un hibridoma de ratón, presenta los genes reagrupados de la cadena pesada m y de la cadena ligera kappa humanas. Para conocer las secuencias de estos genes reagrupados, se procedió a aislar RNA total del hibridoma seguido de la obtención de cDNA utilizando cebadores específicos para la región constante, tanto de la cadena pesada como ligera. Posteriormente se realizaron diversas amplificaciones por la técnica de PCR utilizando cebadores específicos para cada una de las familias de genes V y genes J presentes en el transgen del hibridoma, tanto para la cadena pesada como para la cadena ligera. Los productos de PCR obtenidos fueron purificados y cuantificados en geles de agarosa y se procedió a su secuenciación, utilizando un secuenciador automático de DNA. Cada gen fue secuenciado más de dos veces y en ambas direcciones, con cebadores específicos para la región V y para la región J. La secuencia de la región V (genes reagrupados humanos VHDHJH) de la cadena pesada m humana corresponde a las secuencias 1 (en DNA) y 2 (en proteína) y las secuencias de la región V (genes reagrupados humanos VkJk) de la cadena ligera kappa humana corresponde a las secuencias 3 (en DNA) y 4 (en proteína) (ver hoja adjunta elaborada en el programa PatenIn).
Tras la comparación de estas secuencias con las bases de datos existentes de genes (Genbank), no se ha encontrado identidad al 100 % con ninguna de las secuencias allí existentes, aunque una gran homología con genes humanos de la cadena pesada m y la cadena ligera kappa. El gen de la cadena pesada pertenece a la familia de genes humanos del VH1 y el segmento J de la cadena pesada corresponde al JH4. En el caso del gen de la cadena ligera kappa, éste pertenece a la familia de genes del Vk1 y su segmento J corresponde a la familia del Jk2.
El anticuerpo monoclonal humano SM50/20 reconoce de forma específica un antígeno presente en la membrana celular de los leucocitos humanos. El patrón de reconocimiento del anticuerpo monoclonal humano SM50/20 se determinó mediante técnicas de inmunofluorescencia indirecta y análisis en un citómetro de flujo, utilizando suspensiones celulares de células mononucleares de sangre periférica, plaquetas, diferentes líneas celulares humanas, muestras de médula ósea y con células de sangre periférica de pacientes diagnosticados de distintos tipos de leucemia (linfoide y mieloide crónicas). El resultado de estos análisis se muestra en la Tabla 1, mostrando la intensidad de reconocimiento del anticuerpo con cruces (máxima intensidad está representada con +++), y las células que no son reconocidas por el anticuerpo se expresan con un signo negativo (-).
En la Tabla 1 se observa que el anticuerpo monoclonal humano SM50/20 tiñe selectivamente y de forma específica a leucocitos humanos de sangre periférica de donantes voluntarios sanos, incluyendo a linfocitos T y B, monocitos y granulocitos. El anticuerpo, sin embargo, no reconoce a plaquetas humanas. Cuando se estudia el reconocimiento del anticuerpo sobre distintas líneas celulares tumorales humanas, se observa que el anticuerpo SM50/20 sólo reconoce a la línea tumoral T JURKAT y a la línea tumoral B HMY. Sin embargo, el anticuerpo no reconoce a las líneas celulares humanas U937 (mielomonocítica), K562 (eritroleucemia) o YT-INDI (semejante a NK, NK like). Tampoco reconoce a una línea celular de rata RBL (células leucémicas basófilas).
Cuando el anticuerpo se testa sobre células obtenidas de pacientes que sufren de algún tipo de leucemia se observa que el anticuerpo monoclonal humano SM50/20 es capaz de reconocer a todas las leucemias linfoides crónicas testadas, tanto en células obtenidas de sangre periférica como de médula ósea. La intensidad de reconocimiento de estas leucemias fue alta/máxima en todos los casos.
Con respecto a las leucemias mieloides crónicas, el anticuerpo reconoce sólo a algunas de ellas, tanto en células de sangre periférica como las procedentes de médula ósea. En otros casos, el anticuerpo no reconoce en absoluto (-) o lo hace en baja intensidad (+/-). El patrón de reconocimiento del anticuerpo utilizando los distintos tipos celulares indica por tanto que el anticuerpo monoclonal humano SM50/20 reconoce de forma específica a una molécula presente en la membrana celular de los leucocitos humanos normales, en líneas tumorales linfoides (T y B), en células de sangre periférica y de médula ósea de pacientes con leucemias linfoides crónicas, y en algunas leucemias mieloides crónicas.
La caracterización del peso molecular del antígeno reconocido por el anticuerpo SM50/20 se realizó mediante Western blot. Tras lisado de leucocitos humanos o de las líneas celulares reconocidas por el anticuerpo, se realizó una electroforesis en gel de acrilamida SDS/PAGE en condiciones reductoras (en presencia de b 2-mercaptoetanol) y no reductoras, transfiriendo posteriormente el gel a una membrana. La membrana fue incubada con el anticuerpo SM50/20 seguido de un anticuerpo anti-IgM humano marcado con fosfatasa alcalina y un cromógeno. En ocasiones también se realizó la técnica de quimioluminiscencia, obteniendo los mismos resultados.
En condiciones no reductoras, se observó la presencia de una única banda, indicando el reconocimiento específico del anticuerpo por un antígeno proteico presente en la muestra de los lisados celulares. El peso molecular del antígeno se obtuvo por comparación con la migración de un patrón control que presenta una mezcla de distintas proteínas de peso molecular conocido. Se observó que el peso molecular del antígeno reconocido por el anticuerpo SM50/20 varía dependiendo de la línea celular utilizada (entre 150-180 kd), seguramente debido a cambios en la glicosilación de la molécula, que es dependiente del tipo celular que lo expresa.
En condiciones reductoras, se observó que la banda desaparece en el Western blot, indicando que el epítope reconocido por el anticuerpo se pierde al eliminar los puentes disulfuro por el agente reductor.
La comparación del antígeno reconocido por el anticuerpo SM50/20 tanto en su patrón de reconocimiento en la membrana de las células testadas, como en su peso molecular, con las moléculas ya conocidas y catalogadas dentro del grupo de CD, no ha permitido aseverar a 100 % su analogía con ninguna de ellas.
El anticuerpo fue purificado para su caracte- rización mediante columna de sephadex-Proteína L (proteína que es capaz de unir cadenas ligeras kappa) o utilizando un anticuerpo anti-IgM humana (DA4) unido covalentemente a bolitas de sephadex. El anticuerpo monoclonal humano SM50/20, tanto utilizando sobrenadante del hibridoma productor, como anticuerpo purificado, puede ser utilizado tanto en ELISA, citometría de flujo y Western blot. El anticuerpo es secretado por el hibridoma a una concentración de 1-2 m g/ml utilizando cultivos celulares convencionales (en flasks). Es posible incrementar la producción mediante la obtención de líquido ascítico en ratones con inóculo del hibridoma a nivel intraperitoneal, o mediante flasks especiales cultivando las células a alta densidad.
El anticuerpo monoclonal humano SM50/20 es capaz de activar complemento de conejo in vi- tro, comportándose desde el punto de vista funcional como las inmunoglobulinas de isotipo IgM presentes en el suero humano. Los leucocitos humanos, en presencia del anticuerpo y complemento de conejo, experimentan una muerte celular específica.
Ventajas del producto. Posibles aplicaciones
El producto de la invención es un anticuerpo monoclonal humano que reconoce leucocitos humanos, distintas líneas tumorales leucocitarias humanas y células de sangre periférica y de médula ósea de leucemias linfoides crónicas tipo B, y de algunas mieloides.
El anticuerpo podría ser utilizado en terapia humana en leucemias linfoides crónicas o para eliminar células linfoides de médula ósea en otras patologías. El primer paso sería la producción a gran escala del anticuerpo para su posible utilización terapéutica.
Este anticuerpo podría ser utilizado en terapia complementaria/opcional a las existentes actualmente en el caso de leucemias linfoides crónicas y otras patologías, ofreciendo a los pacientes una alternativa terapéutica. El hecho de que este anticuerpo sea humano en toda su composición proteica, tanto sus cadenas pesadas como ligeras, le hace ser de elección en aquellas terapias en las que se están utilizando anticuerpos de ratón o de rata y donde una respuesta inmunitaria de los pacientes que las reciben inutilizan el tratamiento. Este anticuerpo, al ser humano en su totalidad, no sería rechazado por los pacientes que lo recibieran, lo que permitiría la efectividad de la terapia.